SNK6細胞（人NK/T細胞淋巴瘤細胞）

細胞接收

1. 凍存細胞

如果是干冰運輸的凍存細胞，收到后請立即轉入液氮儲存保存，或直接進行細胞復蘇。

2. 活細胞

收到后用 75%的酒精對 T25 瓶外表面進行消毒，之后放在 5%CO2、37℃的細胞培養箱靜置 2 h，靜置后取出細胞瓶在顯微鏡下觀察細胞貼壁情況和細胞匯合度，分別在 100 X 和 40 X 下各拍 2 個不同視野的細胞拍照記錄。如果匯合度達到 80%以上的傳代密度，可以進行傳 代操作，如果細胞匯合度沒有達 80%以上不夠傳代，棄掉瓶內培養基，更換新鮮完培養基。(灌滿細胞培養基不能正常用來培養細胞)

細胞復蘇

1. 水浴鍋 37℃預熱；

2. 適合該細胞系的完培養基預熱到 37℃；

3. 在 15 mL 離心管中加入 6 mL 完培養基備用；

4. 從液氮中取出細胞，在 37℃水浴中輕輕轉動凍存管，直到凍存管內僅剩余一小塊冰芯，使細胞在 2 min 內迅速解凍（水不能沒過蓋子或用封口膜把凍存管口封上）；

5. 將凍存管轉移到超凈工作臺內；打開蓋子前，用 75％酒精擦拭凍存管外部；

6. 用移液槍吸取細胞凍存懸液，轉移至已預熱的完培養基的離心管內；

7. 細胞懸液以500 g離心 5 min；

8. 離心后，檢查上清液是否清澈，有無完整的細胞沉淀；在無菌條件下，小心吸掉上清液，加入 1 mL 完培養基，輕柔吹打細胞沉淀，充分吹散、混勻；

9. 將細胞接種到 1 個 T25 培養瓶或同等底面積的培養容器，每瓶加入 4 mL 完培養基；

10. 搖勻細胞，放入 37℃、5％CO2 的培養箱中（培養環境取決于細胞和培養基類型）；

11. 復蘇次日，觀察細胞狀態。

(1) 貼壁細胞若細胞貼壁情況良好，可以更換新鮮的完培養基；若觀察到細胞呈圓亮形態 但不貼壁，可以讓細胞繼續培養 24 h 后再進行換液操作。之后，根據細胞的生長狀況，每 2-3 天更換一次完培養基，觀察細胞，生長至 80％以上的匯合度，即需傳代。若細胞生長較慢或匯合度較低時，可以減少換液次數。

(2) 懸浮細胞復蘇后盡量放在相對小一些的容器中，使用含 20％血清的培養基復蘇。懸浮細胞若細胞狀態良好，可以更換新鮮的完培養基；若細胞狀態差且呈現灰度，可以繼續 培養 24 h 后再觀察細胞。觀察發現有活細胞，可進行換液操作，觀察細胞無明顯變化，及時反饋本公司售后。

細胞傳代

1. 貼壁細胞

(1) 將完培養基、PBS、胰酶預熱至 37℃；

(2) 從培養容器中吸棄上清；

(3) 從容器一側輕輕加入 PBS（T25 培養瓶加入約 2 mL）洗滌細胞 1 次。注意動作輕柔，清洗全面，避免攪動細胞層，前后搖晃容器數次吸去 PBS（注：沖洗步驟可去除可能抑制

解離劑作用的少量血清、鈣和鎂）；

(4) 加入胰酶（T25 培養瓶加入約 1 mL），搖晃均勻，保證充分接觸細胞表面。放入培養箱消化；

(5) 顯微鏡下觀察消化情況，約 70％～80％細胞收縮變圓后，輕拍培養容器外壁，使細胞脫離培養表面；

(6) 立即加入 2-3 倍胰酶體積的完培養基（T25 培養瓶加入約 3 mL），隨即輕搖培養容器，使培養基和胰酶迅速混勻，終止消化；

(7) 使用移液管吸取細胞懸液，吹打培養容器底面數次，盡可能將細胞都吹打下來；注意：

吹打動作不可劇烈，避免產生大量氣泡，損傷和損失細胞。

(8) 收集的所有細胞懸液以 500 g 離心 5 min；

(9) 離心后去除上清。加入1 mL完培養基，輕柔吹打細胞沉淀，充分吹散、混勻；

(10) 將細胞按一定的比例傳代接種，建議按照 1：2 進行傳代，若細胞在兩天內長滿可增加傳代比例，若細胞生長三四天還未長滿，可適當縮小傳代比例； 注意：請根據細胞實際生長情況調整傳代比例。

(11) 搖勻細胞，放入 37℃、5％CO2 的培養箱中（如果使用培養瓶，將其放入培養箱前應將瓶蓋旋松，以便進行充分的氣體交換，除非您使用的是通氣式培養瓶和透氣性瓶蓋）；

(12) 傳代次日，觀察細胞狀態。若發現較多死細胞，進行換液操作。之后，每天根據細胞的生長情況更換完培養基，觀察細胞，生長至 80％以上的匯合度，即需傳代或凍存。

2. 懸浮細胞

(1) 將完培養基、PBS、胰酶預熱至 37℃；

(2) 使用移液管吸取細胞懸液，吹打培養容器底面數次，盡可能將細胞都吹打下來；注意：

吹打動作不可劇烈，避免產生大量氣泡，損傷和損失細胞。

(3) 收集的所有細胞懸液以 500 g 離心 4 min；

(4) 離心后去除上清。加入1 mL完培養基，輕柔吹打細胞沉淀，充分吹散、混勻；

(5) 將細胞按一定的比例傳代接種，建議按照 1：2 進行傳代，若細胞在兩天內長滿可增加傳代比例，若細胞生長三四天還未長滿，可適當縮小傳代比例；

注意：請根據細胞實際生長情況調整傳代比例。

(6) 搖勻細胞，放入 37℃、5％CO2 的培養箱中（如果使用培養瓶，將其放入培養箱前應將瓶

蓋旋松，以便進行充分的氣體交換，除非您使用的是通氣式培養瓶和透氣性瓶蓋）；

(7) 傳代次日，觀察細胞狀態。若發現較多死細胞，進行換液操作。之后，每天根據細胞的生長情況更換完培養基，觀察細胞，生長至 80％以上的匯合度，即需傳代或凍存。

細胞凍存

1. 按細胞傳代的方法，收集細胞沉淀，根據沉淀大小加入適量培養基重懸細胞。

2. 用移液管吹打混合均勻，取 20 μL 進行細胞計數；

3. 500 g 室溫離心 5 min，離心后，打開蓋子吸去上清，用 1~2 mL 4℃預冷的凍存液重懸細胞，隨后

4. 加入凍存液調整至密度為 1x10⁶-1x10⁷ 個細胞/mL；

5. 將細胞懸液按 1 mL/管平均分裝至凍存管中，旋緊蓋子，凍存管應提前貼好細胞名稱、細胞代次、數量、凍存日期；

6. 將凍存管放置于 4℃預冷的程序降溫盒中，并在凍存結束的 15 分鐘之內將程序降溫盒放置超低溫冰箱內；

7. 過夜后，將凍存細胞轉移至液氮罐內保存。

! 注意事項

1. 收到常溫細胞后，及時拍照記錄有無漏液/瓶身破損現象。

2. 用 75%酒精擦拭細胞培養瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態。先不要打開培養瓶蓋，將細胞置于細胞培養箱內靜置培養 2~4 小時，以便穩定細胞狀態。

3. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關信息，如貼壁特性、細胞形態、所用基礎培養基、傳代比例、換液頻率等。

4. 靜置完成后，取出細胞培養瓶，鏡檢、拍照，記錄細胞狀態（所拍照片將作為后續服務依據）；建議細胞傳代培養后，定期拍照，記錄細胞生長狀態。

5. 若觀察到異?；驅毎幸蓡?，請及時跟我們聯系；對于細胞培養操作及培養注意事項有疑問的，可跟我們的技術支持交流。

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